Os cientistas geralmente se tornam metafóricos ao tatear maneiras de descrever sua profissão esotérica. Certamente esse é o tack que Eric Johnson toma ao tentar explicar o trabalho de seu colega bioquímico e mentor Ed Schantz. O trabalho de Ed é como uma boa produção de vinho, diz Johnson, 36 anos. Ele pode fazer essas coisas em três semanas, mas levou anos de desenvolvimento para aperfeiçoar sua técnica.
O material que Schantz faz não é Vino; É toxina. Especificamente, é a botulina, a toxina produzida pela bactéria botulinum única e a substância mais venenosa do mundo.
Quando ingerido, a botulina causa botulismo, uma forma de intoxicação alimentar que pode resultar em paralisia muscular e até morte. Mas a botulina também tem um bom lado: em doses muito pequenas, é um tratamento eficaz para uma classe inteira de doenças humanas conhecidas como distonias-espasmos musculares controláveis que os pesquisadores suspeitam são causados por impulsos elétricos involuntários e excessivos do cérebro. Esses espasmos fazem com que as pálpebras pisquem ou se fechem, as vozes param de garganta, pescoços para torcer em contorções dolorosas. Muitas dessas condições, no entanto, estão sendo controladas hoje por injeções de botulina. E todas as doses já administradas por um médico foram feitas por Schantz, um professor emérito de 84 anos e bioquímico no Instituto de Pesquisa de Alimentos da Universidade de Wisconsin em Madison.
Como as várias distonias são relativamente raras-Johnson cita um estudo que estimou a incidência em 391 por milhão de população-as maiores empresas farmacêuticas não tiveram muito incentivo de lucro para produzir a toxina. Além disso, como Johnson observa, a botulina é seis milhões de vezes mais tóxica que o veneno de cascavel. Muitas empresas farmacêuticas não querem se aproximar por razões de segurança dos funcionários. Acrescente a isso o delicado artesanato e a complexidade necessários para produzir as coisas e fica claro por que a capacidade de Schantz de fazer uma toxina pura e eficaz é tão incomum e por que ele está passando esse artesanato, na tradição de um vintner, para Johnson.
Seria muito difícil para alguém aprender o procedimento em um livro, diz Johnson. Ed’s me ensinou a fazer isso; Ele é o mestre. É realmente como fazer vinho. Embora todas as etapas sejam escritas, ainda há uma certa arte para acertar, uma técnica que Ed se refinou ao longo dos anos. Ed também é uma pessoa bastante modesta, mas ele sozinho forneceu toxina a todos em todo o mundo por seu trabalho científico e o fez por pouca ou nenhuma compensação. Se você ler a literatura científica de 1950 a 1980, todos dizem que obtiveram suas toxinas de Ed Schantz.
Uma das razões pelas quais a botulina precisa de um toque de artesão é que é uma molécula muito complexa. (Seu peso molecular é aproximadamente 80 vezes o da insulina, por exemplo.) Consiste em uma grande proteína venenosa acompanhada por um grupo de proteínas estabilizadoras menores que impedem a grande de mudar quimicamente e perder sua potência ao longo do tempo. A utilidade do veneno mortal para a própria bactéria nunca foi descoberta, embora alguns pesquisadores tenham sugerido que, ao matar um animal, a bactéria poderia estar tentando fornecer um bom lar para sua progênie, que pode crescer apenas na ausência de oxigênio. O interior de uma sopa também pode fazer um ambiente nutritivo, desde que não esteja sujeito a muito calor. Isso explica por que o botulismo era comum quando as pessoas enlatavam regularmente sua própria comida. Agora que a maioria das pessoas obtém seus enlatados de uma loja, o botulismo se tornou extremamente raro, pois todos os Canners comerciais aquecem seus produtos até a temperatura necessária para matar os esporos de botulinum.
A toxina faz seu trabalho mortal, ligando -se permanentemente às terminações nervosas. Uma vez que a molécula de botulina está no lugar, os neurotransmissores-produtos químicos que transmitem sinais nervosos-estão impedidos de atingir um músculo, e o músculo rapidamente se enfraquece ou, se o suficiente dos nervos estiver bloqueado, paralisado. As pessoas que morrem de botulismo geralmente o fazem porque sufocam depois que seus músculos no peito estão paralisados. Aqueles que sobrevivem à doença geralmente passam semanas em respiradores e permanecem enfraquecidos por meses, até que novos finais nervosos possam crescer.
O processo de produção da toxina no laboratório tem sido consideravelmente simplificado desde os primeiros dias. Quando ele começou a trabalhar em botulina, Schantz tinha um laboratório de tamanho normal para espalhar seus experimentos. Mas agora ele consegue fazer toda a toxina necessária para pesquisas em um pequeno banco em um escritório combinado não muito maior que um armário de casaco.
Schantz é um mestre de muitos ramos da agricultura de toxinas e criação bacteriana-ele foi o primeiro a purificar e descrever a estrutura química da toxina de marés da maré vermelha-mas a botulina sempre foi sua especialidade. Ele começou a cultivá-lo há quase 50 anos, durante a Segunda Guerra Mundial, enquanto um oficial do exército estacionado em Fort Detrick, Maryland, depois na casa do programa de guerra biológica dos EUA.
A inteligência do Exército indicou que havia o perigo de a botulínia e outras bactérias sendo usadas contra nossas tropas, diz Schantz. Fui designado para trabalhar se uma toxina botulínica poderia ser usada como um possível agente de guerra.
A resposta à pergunta inicial de Schantz foi não. A botulina não seria uma arma eficaz do campo de batalha, porque não permanece potente depois que é exposta ao ar, embora Schantz aponte que ainda pode ser útil para sabotagem (em alimentos que são consumidos sem aquecimento, por exemplo, ou usado como um aerossol em pequenas áreas). Johnson observa também que, durante a Guerra do Golfo, o exército estava devorando toda a toxina que poderia. Eles estão muito preocupados com a guerra que, de alguma maneira desconhecida, poderia empregar botulínico, diz ele. Eles estão armazenando e produzindo seus próprios, na esperança de desenvolver uma imunização e um anti -soro para as tropas.
Após a Segunda Guerra Mundial, Schantz continuou a trabalhar em Fort Detrick como civil. Em 1972, ele deixou o serviço do governo e ingressou no Instituto de Pesquisa de Alimentos, que tinha várias relações de pesquisa com o forte. Quando Schantz chegou a Wisconsin, a aplicação de Botulin a Distonias já havia se tornado uma parte importante de seu trabalho.
Isso começou por volta de 1968, diz Schantz. Fui contactado por Alan Scott, um cirurgião que trabalhava com pacientes que sofriam de estrabismo.
O estrabismo, comumente conhecido como olho cruzado, é causado por um músculo ocular exagerado. Tecnicamente, não é uma forma de distonia. Mas, como as distonias, os nervos afetados pelo estrabismo carregam muitos sinais aos músculos, fazendo com que eles se contraam. Na época em que Scott entrou em contato com ele, diz Schantz, o tratamento usual era cirúrgico: cortar uma parte do músculo hiperativo o enfraqueceria, permitindo que o olho alinhasse corretamente.
Scott perguntou se alguma das toxinas com quem trabalhei pode inativar os músculos espásticos ou hiperativos para que a cirurgia invasiva pudesse ser evitada.
Schantz sugeriu a toxina botulínica, que ele tinha em uma forma cristalina purificada. Seu raciocínio era que a botulina poderia enfraquecer os músculos oculares da mesma maneira que enfraquece os músculos dos sofredores de botulismo. Se alguns desses nervos pudessem ser silenciados, os músculos relaxariam. Se a dose fosse cuidadosamente controlada e a agulha injeta direcionada com precisão, o médico poderia contrabalançar exatamente a doença e restaurar o controle normal do músculo para o paciente.
Schantz e Scott começaram sua colaboração testando botulina em macacos com olho cruzado (que Scott induziu com o mesmo tipo de cirurgia que ele usou para corrigir estrabismo em humanos). Os primeiros resultados mostraram que o tratamento pode funcionar. Embora os resultados não sejam permanentes-as terminações nervosas acabariam crescendo-o Scott pensou que o tratamento poderia ser ajustado para fornecer um alívio significativo. Enquanto Scott continuava os experimentos para estabelecer as melhores dosagens e os melhores lugares para atingir a toxina, Schantz trabalhou para trazer seus procedimentos de fabricação de toxinas de acordo com as regras de administração de alimentos e medicamentos para substâncias dadas aos seres humanos.
Por volta de 1978, diz Schantz, o FDA deu à Scott permissão para prosseguir com voluntários humanos, já que estava acabando que a toxina estava trabalhando bem em macacos. Scott logo estava enviando amostras da toxina para outros médicos em todo o país, que a usaram em muitos mais sofredores de estrabismo que se ofereceram para o tratamento experimental. Scott também começou a experimentar a botulina como um tratamento para um tipo de distonia chamada blefaroespasmo, que causa pisca incontrolável.
Durante anos, o blefaroespasmo-como outras distonias-foi pensado pela maioria dos médicos de natureza psicossomática, e muitos pacientes sofreram muito tratamento equivocado e psicanálise. Ironicamente, diz Schantz, depois de todos esses anos assumindo que a doença era psicossomática, injetando um pouco da toxina nas pálpebras que a limpou. Desde então, os médicos me disseram o quão encantados com seus pacientes estavam agora que tinham alívio por algo que não havia sido tratado anteriormente.
Scott e outros médicos gradualmente aumentaram o escopo de seu ataque de toxinas. A cãibra do escritor crônico e a cãibra do músico, que são especialmente graves para os violinistas, também são distonias que agora são tratadas com botulina (embora as pessoas com cãibras do escritor sejam incentivadas a aprender a escrever com a outra mão). O mesmo acontece com a disfonia, que afeta os músculos da faringe e resulta em uma voz extremamente tensa, bem como no torticolo espasmódico, uma condição especialmente dolorosa e debilitante que faz com que a cabeça se mova incontrolavelmente. Apesar desses sucessos, não foi até dezembro de 1989 que o FDA finalmente declarou que o uso de botulina para o tratamento não era mais experimental, mas uma prática médica estabelecida-e mesmo assim apenas para duas dessas doenças, blefaroespasmo e estrabismo adulto.
Durante todo esse tempo, até o presente, todas as doses de botulina foram preparadas a partir da colheita de 1979 de uma única safra de bactérias que o FDA havia aprovado. Era-selão tirar esse tipo de idade de um único lote, porque a toxina é tão poderosa que uma dose eficaz geralmente é de um milionésimo de um miligrama. (A dose letal para um humano é de cerca de um milésimo de um miligrama.) Schantz pode ganhar até 60 miligramas de um lote de três galões das bactérias vigorosas em um garrafão, um tipo de jarro de vidro usado na bioquímica, bem como na cerveja em casa.
Schantz e Johnson começam colocando algumas células de clostridium botulinum em uma mistura de dextrose, proteína do leite digerido e extrato de levedura de Brewer. Como as bactérias não estão competindo com outros microorganismos, eles podem se multiplicar rapidamente, transformando o médio de um marrom nublado em 18 a 24 horas.
A bactéria tem um ciclo de vida natural interessante, diz Johnson. Faz um esporo distribuído em todo o mundo em água e solo. Se você colher amostras de solo em todo o mundo, descobrirá que os esporos existem naturalmente em dez a trinta por cento dessas amostras. E quando o esporo entra em alimentos e as condições estão certas-essas condições incluem temperaturas acima de 50 graus, um certo nível de acidez e uma ausência de oxigênio-ele crescerá em uma bactéria em forma de vara. Então tem uma escolha; Ele faz mais esporos, ou, quando os nutrientes se tornam limitados, passa pelo que consideramos uma lise em massa ou suicídio celular. Quando fazemos a toxina, depois que a cultura fica nublada a ponto de você não pode ver através dela, ela dissolve sua própria parede celular, por razões que não entendemos. É quando a toxina é liberada da célula. Então a cultura se limpa e você verá através dela.
No laboratório, leva cerca de três dias para aumentar a cultura das bactérias e produzir o líquido claro e contendo botulina. Mas os próximos passos são bastante complicados.
Uma vez que a toxina é dissolvida no fluido, precisamos isolá -la, diz Schantz. Fazemos isso por um processo conhecido como precipitação. O ácido sulfúrico é adicionado à solução; A maior acidez torna a toxina insolúvel e se estabelece em uma espécie de mistura lamacenta.
A lama contém a botulina, juntamente com outras substâncias produzidas pelas bactérias. Embora a lama funcionasse bem como veneno, não seria aconselhável injetar uma substância tão impura em um paciente de distonia. Portanto, o processo de purificação é repetido. A lama é redissolvida em uma solução salina e novamente precipitada com ácido, depois redissolved e precipitada mais uma vez, desta vez usando álcool a uma temperatura de -5 graus Celsius.
Cada vez que eles se dissolvem e precipitam, alguns dos produtos bacterianos indesejados permanecem na solução, e o precipitado se aproxima da toxina pura. A etapa final é redissolver a solução e adicionar sulfato de amônio. Isso faz com que a botulina chore Estalize -se em agulhas microscópicas em forma de vidro que são compostas por uma toxina muito pura.
Essa descrição não começa a cobrir os meandros do processo, mas também uma descrição mais técnica. Como muitos outros procedimentos biológicos, dos quais a criação de vinhos é uma, é tanto uma questão de toque e tradição quanto o conhecimento técnico. A etapa de cristalização é especialmente delicada, e é onde a arte de Schantz e Johnson entra em cena.
Muitas dessas coisas são chamadas de julgamento, diz Schantz. Você precisa adicionar sulfato de amônio suficiente para que a toxina não precipite. Às vezes, você verá apenas um pouco de opalescência, então precisa refrigerá -lo por alguns dias e esperar que os cristais se formem. Mas você precisa saber quando adicionar o sulfato de amônio e quanta opalescência deve haver. Caso contrário, você não receberá os cristais puros.
Schantz e Johnson não usam técnicas modernas, como colunas ou reatores químicos automatizados, o que pode facilmente facilitar o processo. Em uma coluna, os produtos químicos são reunidos e separados por resinas que se ligam às moléculas e depois-teoricamente-liberem-as.
Com uma coluna, você corre o risco de obter vestígios das resinas em sua toxina, diz Johnson, e também perde as proteínas estabilizadoras que impedem a toxina de perder sua potência. O método de precipitação evita esses problemas. É um procedimento praticamente ninguém no mundo mais usa, exceto nós; É considerado antiquado e não em voga.
Os britânicos estão usando enzimas e colunas para criar um produto de toxina botulínica, mas não achamos que a qualidade seja tão boa; Houve alguns efeitos colaterais. Claro, também estamos sendo subjetivos. Um químico de proteínas pode dizer que as técnicas modernas também funcionariam; Mas tudo o que sabemos é que o que fizemos de obras é o melhor até agora.
As técnicas Schantz e Johnson usam são tão comuns que podem ser improvisadas na cozinha de alguém. Você pode fazer isso de toxin, diz Johnson. Mas manter a alta toxicidade na cultura e as propriedades da toxina à medida que você purifica é o que você precisa ter muitos anos para saber como fazer.
O lote que eles produziram em 1979 foi adquirido em 1990 pela Allergan Pharmaceuticals depois que Allergan comprou Oculinum, uma pequena empresa formada por Scott. Allergan acabou de entrar nele, observa Johnson, no sentido de que eles compraram um medicamento sem ter que investir nos anos de desenvolvimento e altos custos de pesquisa que acompanham a maioria das pesquisas sobre drogas.
Schantz e Johnson não terão que se preocupar em fazer mais toxinas para uso médico em breve. O lote de 1979 deve durar mais cinco anos. Mas eles produzem continuamente toxina para pesquisa. Neurologistas e outros pesquisadores precisam dele para desenvolver tratamentos para doenças que não sejam distonias; Um uso possível pode estar no tratamento de espasmos musculares associados à paralisia cerebral e à esclerose múltipla. (Um ensaio clínico em andamento com 12 crianças atingido por paralisia cerebral demonstrou promessa, observa Johnson.) E em maio passado, Mitchell Brin, neurologista da Columbia, relatou algum sucesso preliminar no tratamento de pacientes que sofrem de gagueira grave; Ele injetou a toxina em suas cordas vocais. Se seu método for eficaz em novos testes, poderá aliviar cerca de 2,5 milhões de americanos.
Portanto, continuará a haver um ou dois pequenos frascos contendo a cultura botulinum marrom e obscura no Workbench de Schantz e Johnson, ou talvez a solução clara de uma fase posterior da produção de toxinas. E o Instituto de Pesquisa de Alimentos ainda terá que perguntar a certos funcionários em potencial se eles estariam dispostos a desenvolver uma imunidade ao botulismo como parte de seu trabalho. Não é um processo particularmente complicado-três doses da toxina botulínica são injetadas no novo trabalhador do laboratório por um período de três meses-, embora tende a adiar muitas pessoas.
Mas olhe para o lado positivo, dizem os pesquisadores. Você seria capaz de comer de latas desleixadas.